Oui, le mélange de l'eau et du vin dans le calice avant sa consécration est obligatoire. Le fait de ne pas ajouter l'eau est illicite, mais n'affecte pas la validité du sacrement.

Ce qui rend cet acte significatif, c'est ce qu'il représente : l'eau est l'humanité du Christ et le vin sa divinité. Le mélange de l'eau et du vin dans le calice symbolise l'incarnation du Christ. Il rappelle également la Passion du Christ, lorsque les soldats lui ont transpercé le côté avec une lance et que du sang et de l'eau ont coulé (Jean 19, 34), signifiant ainsi le baptême et l'eucharistie.

Le fait de mélanger l'eau et le vin pour le sacrifice était une pratique de l'Église primitive. Saint Cyprien de Carthage (250 apr. J.-C.) écrit dans son épître sur la signification du mélange de l'eau et du vin :

Parce que le Christ nous a tous portés, en ce sens qu'il a porté nos péchés, nous voyons que par l'eau, les personnes sont signifiées, tandis que dans le vin, en effet, le sang du Christ est montré. Et lorsque l'eau est mélangée au vin dans la coupe, le peuple est un avec le Christ, et la multitude des croyants est liée et unie à celui en qui elle croit (W.A. Jurgens, The Faith of the Early Fathers, Vol. 1, 232).

Dans sa Somme théologique (art. 6), saint Thomas d'Aquin répond à la question de savoir s'il faut mélanger de l'eau au vin :

L'eau doit être mêlée au vin qui est offert dans ce sacrement. Tout d'abord en raison de son institution : on pense en effet avec vraisemblance que notre Seigneur a institué ce sacrement dans du vin tempéré avec de l'eau, selon la coutume de ce pays : c'est pourquoi il est écrit (Proverbes 9:5). Le pape Alexandre Ier dit (Ep. 1 ad omnes orth.) : "Dans le calice du Seigneur, il ne faut offrir ni vin ni eau, mais les deux mélangés, car nous lisons que les deux ont coulé de son côté lors de la Passion. Troisièmement, parce que cela convient pour signifier l'effet de ce sacrement, puisque, comme le dit le pape Jules (Concil. Bracarens iii, can. 1) : "Nous voyons que le peuple est signifié par l'eau, mais que le sang du Christ est signifié par le vin. C'est pourquoi, lorsque l'eau est mélangée au vin dans le calice, le peuple ne fait plus qu'un avec le Christ". Quatrièmement, parce que cela convient au quatrième effet de ce sacrement, qui est l'entrée dans la vie éternelle : c'est pourquoi Ambroise dit (De Sacram. v) : "L'eau coule dans le calice et jaillit pour donner la vie éternelle.